Новий клас рослинних біостимуляторів та противірусних засобів, що має великі перспективи — білки гарпінової групи

Сфера біостимуляторів та ад’ювантів активно розвивається, пропонуючи новітні продукти з синергічною дією. Однією з таких інновацій є гарпінові білки – науково обґрунтований новий клас біостимуляторів.

Гарпінові білки є класом природних білків, що виділяються грамнегативними фітопатогенними бактеріями. Їхні особливості – високий вміст гліцину, виняткова термостабільність та значна кислотність. Це унікальне поєднання структурних характеристик робить їх відмінними від більшості природних білків.

На відміну від традиційних рослинних поживних речовин чи хімічних регуляторів росту, гарпінові білки не постачають рослинам поживних речовин і не впливають безпосередньо на їхній ріст. Натомість, вони функціонують як молекулярні сигнали. Науковці порівнюють їх із “сигналом пробудження”, який активує вже наявні в рослині механізми росту та захисту. Після застосування таких білків, рослини демонструють низку помітних фізіологічних змін: покращується ефективність фотосинтезу, зростає стійкість до захворювань та толерантність до стресових умов, таких як посуха чи екстремальні температури.

Важливо зазначити, що ці реакції є мобілізацією внутрішніх ресурсів рослини, а не прямим результатом внесення зовнішніх речовин.

З огляду на це, гарпінові білки класифікуються як біостимулятори як науковою спільнотою, так і агрохімічною галуззю. Вони стоять в одному ряду з гуміновими речовинами, екстрактами морських водоростей та білковими гідролізатами. Проте, механізм дії гарпінових білків суттєво відрізняється від інших біостимуляторів.

Завдяки своєму унікальному способу дії, деякі гарпінові білки також зареєстровані як біофунгіциди та біонематоциди на ринках США, Бразилії та Мексики. Там вони використовуються спільно зі стандартними фунгіцидами та нематоцидами для досягнення синергетичного ефекту.

Відкриття гарпінових білків

Відкриття гарпінових білків стало результатом несподіваного дослідження у сфері фітопатології.

У 1992 році команда дослідників Корнельського університету вивчала механізм розвитку бактеріального опіку – руйнівної хвороби груш та яблунь, спричиненої бактерією Erwinia amylovora. Метою дослідження було з’ясувати, як цей патоген шкодить рослинам-хазяям.

Під час експерименту вони ввели до листя тютюну специфічний білковий екстракт бактерії. Несподівано, рослини не виявили жодних ознак хвороби. Натомість, навколо місця введення з’явилася зона швидко відмираючих клітин. Ця реакція, коли рослини жертвують локалізованими клітинами для стримування потенційного загарбника, відома в імунології рослин як гіперчутлива реакція (ГР). По суті, це контрольоване “самоспалення” рослини для запобігання ширшому поширенню інфекції.

Ще більш дивовижним для дослідників було те, що цей білок зберігав свою повну активність навіть після 15-хвилинного кип’ятіння у воді – надзвичайна властивість для білка.

Білок отримав назву “гарпін”, а результати дослідження були опубліковані в журналі Science. На той час ніхто не міг передбачити, що це відкриття через три десятиліття знайде широке застосування в сільському господарстві.

Природна роль гарпінових білків

Гарпінові білки є частиною інфекційного механізму фітопатогенних бактерій, але розуміння цієї ролі є ключовим для усвідомлення їхньої безпеки при використанні.

Грамнегативні рослинні патогени розвинули складний апарат для виділення білків, відомий як система секреції III типу (T3SS). Його можна уявити як молекулярний шприц: його основна функція полягає у прямому введенні бактеріальних ефекторних білків у клітини рослин, де вони порушують рослинну імунну сигналізацію, сприяючи поширенню патогена.

Найбільша спільнота СуперАгрономів у Facebook

Гарпінові білки виступають як допоміжні елементи в цій системі, а не як основні чинники, що викликають хворобу. Вони виділяються в позаклітинний простір (простір поза клітиною рослини), а не проникають у саму клітину. Їхня функція полягає в допомозі ефекторним білкам долати бар’єр плазматичної мембрани рослини, шляхом взаємодії з ліпідами мембрани, формування іонних каналів та олігомеризації білків.

Саме така позаклітинна локалізація забезпечує безпеку гарпінових білків для сільськогосподарського використання: вони діють на зовнішній поверхні рослинних клітин, не проникають у ядро та не втручаються в геном рослини.

На сьогодні гарпінові білки ідентифіковані та вивчені у багатьох видах фітопатогенних бактерій, включаючи HrpZ1 та HrpW1 з Pseudomonas syringae, HrpN з Erwinia amylovora та Hpa1 з Xanthomonas spp. За структурою білкового домену вони поділяються на чотири основні групи, які разом називають гарпіновими білками.

Чому гарпінові білки корисні для рослин?

Як білок, що еволюціонував як частина бактеріальної інфекційної системи, може він мати позитивні ефекти при застосуванні до рослин? Відповідь криється в логіці розпізнавання рослинних імунних систем.

Протягом еволюції рослини розвинули здатність розпізнавати специфічні молекулярні маркери патогенів. Коли гарпінові білки – молекули, пов’язані з бактеріальними патогенами – сприймаються поверхневими рецепторами рослинних клітин, вони запускають каскад реакцій захисту та росту. Логіка рослини полягає в наступному: “Я отримую цей сигнал, що означає можливу небезпеку – я готую свій захист”.

Коли гарпінові білки застосовуються за відсутності реального патогена, захисна реакція активується, але інфекції не відбувається. Результат: імунні переваги зберігаються, але ризик інфекції дорівнює нулю.

За десятиліття досліджень та в різних системах вирощування сільськогосподарських культур послідовно відзначалися такі ключові ефекти:

• Підвищення стійкості до хвороб: індукція білків, пов’язаних із патогенезом (PR), та активація системної набутої стійкості (SAR) – це аналог “широкоспектрового імунного оновлення” рослини. На томатах було продемонстровано суттєве зниження ураження фітофторозом та сірою гниллю.
• Стимуляція росту: прискорений розвиток кореневої системи, поліпшення ефективності фотосинтезу та загальне посилення росту рослин. Це задокументовано на Arabidopsis, рисі, тютюні та інших культурах.
• Стійкість до шкідників: Arabidopsis, оброблений гарпіновими білками, показав значно вищу стійкість до попелиці; через сім днів після зараження популяції попелиці були приблизно на третину меншими, ніж у контрольної групи.
• Покращена посухостійкість: рослини рису, що надмірно експресували гени, відповідальні за синтез гарпіну, демонстрували вищі показники виживання та краще збереження врожаю в умовах дефіциту вологи.

Карта ґрунтів

Інтерактивна карта ґрунтового покриву України

Які сигнальні шляхи активують гарпінові білки?

Ключовим для розуміння гарпінових білків є усвідомлення того, що вони впливають не на один, а на декілька взаємопов’язаних сигнальних шляхів у рослині. Ця багатошляхова, багатовимірна реакція робить їхній вплив ширшим і стабільнішим, ніж у продуктів, що покладаються на один конкретний механізм.

Дослідження виділяють три основні категорії шляхів, що активуються гарпіновими білками:

Іонні канали

• Калієві (K⁺) канали. Гарпінові білки стимулюють випрямляючі струми K⁺ через плазматичну мембрану. Доведено, що HrpN з бактерії бактеріального опіку значно активує калієві канали в клітинах Arabidopsis, змінюючи мембранний потенціал і запускаючи каскади захисних сигнальних шляхів.
• Аквапорини (білки водних каналів). Гарпіни безпосередньо взаємодіють з внутрішніми білками плазматичної мембрани (аквапоринами, такими як PIP1;4), регулюючи транспорт води та CO₂ через рослинні клітини. Це впливає на ефективність фотосинтезу та загальний ріст рослин, що частково пояснює покращення використання води, опосередковане гарпіном.
• Приплив іонів кальцію (Ca²⁺). Обробка гарпіном запускає позаклітинне підлужування в рослинних клітинах – ранню захисну реакцію – процес, що залежить від припливу Ca²⁺. Дослідження показують, що блокування кальцієвих каналів пригнічує гіперчутливу реакцію, встановлюючи сигналізацію Ca²⁺ як критичний ранній вузол у ланцюзі реакції на гарпін.

Шляхи захисту та гормональної сигналізації

• Шлях сигналізації саліцилової кислоти (SA). Це основний шлях, що лежить в основі системної набутої стійкості (SAR) – найпоширенішого імунного механізму рослин. Гарпіни активують експресію генів NDR1 та EDS1, стимулюючи біосинтез та накопичення саліцилової кислоти, що в кінцевому підсумку індукує широкоспектрову стійкість до різноманітних патогенів. На практиці: гарпін підготовлює імунну систему рослини до будь-якого потенційного захворювання.
• Сигналізація активних форм кисню (ROS) та оксиду азоту (NO). Гарпіни активують ферменти RBOH та NOS, викликаючи швидке зростання рівня активних форм кисню та оксиду азоту. Ці дві сигнальні молекули діють узгоджено, регулюючи інтенсивність та масштаби гіперчутливої ​​реакції (HR) – локалізованої запрограмованої загибелі клітин, яка фізично зупиняє поширення патогена.
• Сигнальний шлях етилену (ET). Гарпіни регулюють біосинтез та накопичення етилену. Етилен, у свою чергу, активує транскрипційні фактори EIN2 та EIN3/EIL1, посилюючи як імунну активацію, так і реакції стимуляції росту. Мутанти етиленового шляху демонструють помітно ослаблені реакції на обробку гарпіном, що підтверджує його роль як центральної сигнальної осі.
• Сигнальний шлях гібереліну (GA). Гарпіни стимулюють біосинтез гіберелінів. Знімаючи інгібуючий вплив білків DEL, які зазвичай стримують сигнальний шлях GA, гарпіни сприяють подовженню клітин та загальному росту рослин. Це додаткове гормональне пояснення переваг росту, спостережуваних у польових дослідженнях.

Інші важливі шляхи

• Каскад MAPK (Каскад протеїнкінази, активованої мітогеном). Гарпіни активують сигнальні каскади MAPK – внутрішню систему “ретрансляції повідомлень” рослини, яка перетворює позаклітинні сигнали на скоординовані реакції експресії генів усередині клітини.
• Шляхи, пов’язані з гіперчутливою реакцією (ГР). ГР, індукована гарпіном, також включає порушення мітохондріальної функції та пригнічення локального клітинного дихання – механізми, що сприяють формуванню ефективного захисного бар’єру в місці інфекції.
• Регуляція транскрипції. Гарпіни викликають зміни експресії широкого спектру генів рослин, що стосуються біосинтезу клітинної стінки, міжклітинної комунікації, передачі сигналів та вторинного метаболізму. Варто зазначити, що різні гарпінові білки демонструють різні переваги через шляхи: HrpZ переважно діє через іонні канали та сигналізацію SA, тоді як Hpa1 має інший акцент, що вказує на те, що гарпінові білки з різних бактеріальних джерел мають свої унікальні сигнальні особливості.

Здатність гарпінових білків одночасно забезпечувати стимуляцію росту, підвищення стійкості до хвороб та стресостійкість випливає з мережі сигналів, що охоплює три рівні: іонні канали, рослинні гормони та внутрішньоклітинні сигнальні каскади. Ця багатошляхова синергія є визначальною характеристикою, яка відрізняє гарпінові білки від біостимуляторів, що діють за одним механізмом. Коли клієнти запитують, чому гарпін забезпечує кілька переваг одночасно, відповідь така: він активує власну багатошарову систему захисту та росту рослини за одне застосування.

Незвичайні фізико-хімічні властивості гарпінових білків

Порівняно з більшістю білків, гарпінові білки мають кілька структурно незвичайних характеристик, і саме ці особливості надають їм функціональної універсальності та практичних переваг для розробки препаратів.

• Високий вміст гліцину. Гліцин становить понад 15% від загальної кількості амінокислот у більшості гарпінових білків, що значно перевищує середні показники для білків. Як амінокислота з найменшим бічним ланцюгом, її велика кількість забезпечує виняткову гнучкість основи, без фіксованої, жорсткої тривимірної конформації. Ця структурна гнучкість, ймовірно, дозволяє гарпіновим білкам взаємодіяти з різноманітними компонентами мембрани та рецепторними мішенями.
• Практична відсутність цистеїну. Цистеїн утворює дисульфідні зв’язки, які стабілізують тривимірну структуру більшості білків. Гарпінові білки майже не містять цистеїну, що означає відсутність у них щільної, жорстко упакованої структури, властивої більшості білків, і саме тому їхню структуру складно передбачити обчислювально.
• Виняткова термостабільність. Гарпінові білки зберігають повну біологічну активність після 15-хвилинного кип’ятіння. Оскільки вони не мають чутливої до температури третинної структури, яку можна втратити, вони набагато краще переносять термічну обробку, ніж звичайні білки. Це має пряме практичне значення: спрощує промислове вилучення та обробку препаратів на основі ферментації.
• Висока кислотність. Теоретична ізоелектрична точка більшості гарпінових білків знаходиться в діапазоні pH 4,0-5,0, тобто вони несуть загальний негативний заряд при фізіологічному pH. Це впливає на їхню поведінку в апопласті рослини та їхню взаємодію з мембранними ліпідами.

Від інструменту патології до сільськогосподарського продукту

Після підтвердження лабораторної цінності гарпінових білків, комерційні розробки розпочалися наприкінці 1990-х років у Сполучених Штатах. Компанія Eden Bioscience розробила продукт на основі гарпіну під назвою “Messenger”, який отримав регуляторні дозволи на окремих ринках.

Однак, рання комерціалізація не була безпроблемною. Шлях від ферментаційного виділення біологічно активного білка до стабільного комерційного препарату містив потенційні втрати активності на кожному етапі. Стабільність від партії до партії, відтворюваність польової ефективності в різних регіонах, а також інтеграція з існуючими програмами внесення добрив та пестицидів – жодна з цих проблем не була належним чином вирішена в продуктах раннього покоління, що обмежувало їхнє проникнення на ринок.

Починаючи з 2010-х років, коли загальний ринок біостимуляторів почав набирати обертів, а світова аграрна політика все більше фокусувалася на зменшенні залежності від синтетичних добрив та пестицидів, гарпінові білки знову привернули увагу агрохімічної промисловості. Нове покоління розробників впровадило більш досконалі процеси ферментації, суворіші стандарти ізоляції та характеристики, а також більш систематичні протоколи багаторазової польової валідації.

На сьогоднішній день продукти на основі гарпінових білків, отриманих з Pseudomonas syringae (позначених як гарпіновий білок Pss), завершили або активно проходять процес реєстрації в регуляторних органах багатьох країн та регіонів. Вони орієнтовані на овочеві, польові та спеціальні культури в різних сільськогосподарських системах.

Джерело: Choi MS et al. Harpins, Multifunctional Proteins Secreted by Gram-Negative Phytopathogenic Bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions 26(10):1115–1122.

Переклад SuperAgronom.com

Світлини та відео про життя і роботу агрономів в Instagram SuperAgronom_

Думка редакції SuperAgronom.com може не збігатися з точкою зору автора. Редакція не несе відповідальності за достовірність і тлумачення наданої інформації і виконує виключно роль носія.